RT-QPCR EasyTM Taqman Satu Langkah Real Time RT-PCR Master Mix

RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-Taqman

Untuk PCR waktu nyata menggunakan cDNA, DNA murni

Perkenalan produk

Foregene One-Step RT-PCR Produk seri Easy mewujudkan reaksi terintegrasi dari RNA ke DNA untai ganda, yaitu, transkripsi balik dan amplifikasi PCR diselesaikan dalam tabung sentrifus reaksi yang sama dan sistem reaksi yang sama, sehingga langkah-langkah eksperimental disederhanakan, rencana percobaan dioptimalkan, dan efisiensi percobaan ditingkatkan.

RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-Taqman menggunakan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase, sistem qPCR Taqman yang dioptimalkan dapat dengan cepat dan spesifik melakukan deteksi kuantitatif RT-qPCR Waktu Nyata dari templat RNA jejak.

Kondisi transportasi dan penyimpanan

• Kondisi transportasi: Seluruh proses diangkut dalam kotak es bersuhu rendah untuk memastikan bahwa kit dalam keadaan <4°C.
• Kondisi penyimpanan: Kit disimpan pada suhu -20℃.Simpan produk di lemari es dengan suhu konstan pada -20℃ segera setelah diterima.Jika kondisi penyimpanan sesuai, produk tidak akan menurunkan kinerja apa pun selama masa berlaku 1 tahun.

Informasi komponen kit

• 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman: Transkriptase Terbalik Asal, Inhibitor RNase, Polimerase DNA HotStar Taq Foregene, rasio optimal dNTP, Mg2+, penstabil, penambah, dan pengoptimal.
• Pewarna Referensi ROX: Umumnya digunakan pada siklus termal PCR Waktu Nyata dari perusahaan seperti ABI, Stratagene, dll., untuk menyesuaikan perbedaan antara tabung PCR yang disebabkan oleh kesalahan pemuatan sampel PCR.Konsentrasi Pewarna Referensi ROX yang dibutuhkan oleh instrumen yang berbeda berbeda, dan pengguna dapat menambahkannya sesuai dengan konsentrasi instrumen yang direkomendasikan.

Tindakan pencegahan:

u Reagen harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang, jika tidak kinerja reagen akan menurun atau menjadi tidak valid.

u Reagen dalam kit harus terlindung dari cahaya dan disimpan pada suhu -20°C.

u Direkomendasikan untuk menggunakan ekstraksi sampel segar atau RNA template yang disimpan pada suhu -80 °C (RNA harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang).

u Untuk menghindari kontaminasi RNase, lakukan percobaan di ruang RNase-Free;ujung pipet dan tabung PCR yang digunakan harus bebas RNase;dan memakai sarung tangan dan masker sekali pakai.

u Kit ini harus digunakan dengan primer khusus untuk eksperimen.Silakan pilih primer spesifik untuk gen yang akan diamplifikasi sesuai dengan kebutuhan percobaan.

u Sebelum digunakan, taruh 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman di atas es agar benar-benar meleleh, jentik dan aduk rata sebelum digunakan;persiapan sistem harus dioperasikan pada penangas es untuk meningkatkan kinerja kit dan meningkatkan amplifikasi PCR.

Konsentrasi RNA templat

RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-Taqman:(1 pg-100 ng total RNA)/20 l sistem.

Panduan operasi

A: Persiapan bahan dan reagen

• Siapkan template RNA yang telah disiapkan (disarankan untuk menggunakan kit seri Foregene Total RNA Isolation Kit untuk mengekstrak dan memurnikan RNA), primer spesifik (10 M) dan bahan habis pakai serta instrumen terkait.

Catatan: Harap pastikan integritas RNA dan coba gunakan RNA yang diekstraksi dari sampel segar.

• Taruh 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman, RNase-Free ddH2O, dan 20× ROX Reference Dye (jika perlu) di atas es agar mencair secara alami, dan jentikkan dinding tabung agar tercampur hingga digunakan.

B: Persiapan sistem RT-qPCR

2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman nyaman dan cepat digunakan, dan menghindari polusi selama operasi dan kesalahan eksperimental yang disebabkan oleh berbagai persiapan sistem reaksi hingga batas terbesar.Saat menggunakan, hanya setengah volume sistem reaksi (misalnya, jika sistem reaksi adalah 20 l, ambil 10 l 2× larutan RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman), tambahkan jumlah template RNA dan primer spesifik yang sesuai, dan tambahkan RNase-Free ddH2O untuk membuat volume.Persiapan sistem reaksi RT-qPCR spesifik dapat merujuk pada Tabel 1 di bawah ini.

Tabel 1: Persiapan sistem RT-qPCR

Catatan: Forward Primer dan Reverse Primer adalah primer spesifik untuk gen target.Sistem qPCR dapat disesuaikan sesuai dengan kebutuhan eksperimental dan model PCR.Untuk konsentrasi akhir sebagian besar primer, kami merekomendasikan 400nM.Harap sesuaikan dosis primer dan Probe spesifik sesuai dengan konsentrasi yang disiapkan sesuai dengan konsentrasi akhir yang kami rekomendasikan.Untuk qPCR dengan sistem 50μl, silakan merujuk ke sistem 20μl untuk menyesuaikan jumlah reagen secara proporsional.

1*: Pilih konsentrasi akhir ROX Reference Dye yang sesuai dengan instrumen PCR kuantitatif yang berbeda.Konsentrasi optimal ROX Reference Dye untuk mesin PCR kuantitatif umum ditunjukkan pada tabel berikut:

C: Pengaturan sistem reaksi RT-qPCR

• Setelah menyiapkan sistem RT-qPCR dengan mengacu pada tabel di atas, aduk perlahan (Anda dapat menggunakan ujung pipet untuk memipet dengan lembut; Anda juga dapat mencampur pada vortexer dan centrifuge sebentar untuk mengumpulkan cairan yang tersebar di dinding tabung atau tutup tabung, dan letakkan di kotak es untuk digunakan nanti).
• Lihat pengaturan program reaksi RT-qPCR (Tabel 2) untuk mengatur suhu dan waktu reaksi.

Catatan: Untuk memastikan aktivitas 2× RT-qPCR EasyTM Mix-Taqman dan meningkatkan efisiensi amplifikasi, yang terbaik adalah menyiapkan sistem reaksi RT-qPCR setelah menyiapkan program instrumen PCR, sehingga program reaksi dapat dimasukkan segera setelah persiapan sistem selesai.

• Untuk mendapatkan efek qPCR terbaik, PCR gradien dapat digunakan untuk mengoptimalkan kondisi reaksi untuk templat yang berbeda dan primer yang berbeda.

Catatan: Kisaran suhu ekstensi Foregene Hotstar Taq DNA Polymerase yang disediakan dalam kit ini adalah: 60-72℃, dan suhu ekstensi terbaik adalah 72℃.

Berikut ini adalah contoh kondisi reaksi RT-qPCR.Disarankan untuk menggunakan metode dua langkah untuk reaksi PCR.Ketika konsentrasi template terlalu rendah untuk menyebabkan amplifikasi non-spesifik, nilai Tm primer yang rendah menyebabkan efisiensi amplifikasi yang rendah atau pengulangan kurva amplifikasi yang buruk, dll., disarankan untuk mencoba metode tiga langkah untuk reaksi PCR.Lihat Tabel 2-1 (metode dua langkah) dan Tabel 2-2 (metode tiga langkah) untuk pengaturan kondisi reaksi RT-qPCR.

Tabel 2-1: Pengaturan program reaksi RT-qPCR (metode dua langkah)

Tabel 2-2: Pengaturan program reaksi RT-qPCR (metode tiga langkah)

1*: Waktu transkripsi terbalik dapat disesuaikan sesuai dengan kebutuhan eksperimental.Gen endogen umum seperti -Actin hanya membutuhkan 10 menit;untuk mendeteksi gen tertentu yang diekspresikan, waktu transkripsi terbalik dapat diperpanjang sesuai kebutuhan.

2*: Tetapkan waktu tertentu sesuai dengan panjang fragmen target yang diperkuat.Kecepatan amplifikasi Foregene HotStar Taq DNA Polymerase adalah 2kb/mnt

Catatan: Kondisi reaksi PCR bervariasi tergantung pada kondisi struktural templat, primer, dll. Untuk templat RNA dengan struktur sekunder kompleks, disarankan untuk menggunakan 42℃ untuk langkah pertama transkripsi balik.Dalam operasi spesifik, perlu dirancang kondisi reaksi yang optimal sesuai dengan kondisi spesifik seperti ukuran fragmen target, urutan dasar fragmen yang diamplifikasi dan kandungan GC dan panjang primer, termasuk suhu annealing, ekstensi waktu, dll.

Alur Kerja: