RT-QPCR EasyTM I Satu Langkah SYBR Green I Menyelesaikan Deteksi Kuantitatif Gen Untuk RT Dan PCR Waktu Nyata

RT-QPCR EasyTM I (Satu Langkah)-SYBR Green I Dengan Cepat Menyelesaikan Deteksi Kuantitatif Gen Untuk RT Dan PCR Real Time

RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-SYBR Hijau I

Cat.No.RT-02111/02112

Campuran Master RT-PCR Real-Time Satu Langkah

Untuk penggunaan penelitian saja

Toko di -20℃

perkenalan produk

RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-SYBR Green Imenggunakan sistem unik untuk menggabungkan reaksi PCR RT dan Real Time secara efektif, yang dapat dengan cepat menyelesaikan deteksi kuantitatif gen.Produk ini memiliki toleransi yang kuat, spesifisitas dan stabilitas yang tinggi.Produk ini mengandung Foregene HotStar Taq DNA Polymerase unik perusahaan, yang memiliki keunggulan amplifikasi lebih cepat (2Kb/min), efisiensi amplifikasi tinggi, kemampuan amplifikasi spesifik yang kuat, dan tingkat ketidakcocokan yang rendah dibandingkan dengan enzim Taq biasa.Ini digunakan di sini untuk RT-PCR Waktu Nyata untuk mengurangi amplifikasi non-spesifik dan meningkatkan akurasi PCR.

Fitur

Kit satu langkah membuat transkripsi balik dan qPCR dua reaksi dalam tabung yang sama, hanya perlu menambahkan RNA templat, primer PCR spesifik, dan ddH2O Bebas RNase.

Kit ini dapat dengan cepat dan efisien secara kuantitatif menganalisis RNA virus atau melacak RNA.

Kit ini menggunakan reagen transkripsi terbalik Foregene yang unik dan Foregene HotStar Taq DNA Polymerase yang dikombinasikan dengan sistem reaksi unik untuk secara efektif meningkatkan efisiensi amplifikasi dan spesifisitas reaksi.

Sistem reaksi yang dioptimalkan membuat reaksi memiliki sensitivitas deteksi yang lebih tinggi, stabilitas termal yang lebih kuat, dan toleransi yang lebih baik.

Kit RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-SYBR Green I dilengkapi dengan pewarna referensi internal ROX, yang dapat digunakan untuk menghilangkan latar belakang sinyal dan kesalahan sinyal antar sumur, yang nyaman bagi pelanggan untuk digunakan dalam berbagai model instrumen PCR kuantitatif.

Isi Paket

Kondisi transportasi dan penyimpanan

1.Kondisi transportasi

Seluruh proses transportasi kotak es suhu rendah, untuk memastikan bahwa kit dalam keadaan <4 °C.

2. Kondisi penyimpanan

• Kit ini disimpan pada -20℃.Simpan produk di lemari es dengan suhu konstan pada -20℃ segera setelah diterima.Jika kondisi penyimpanan sesuai, produk tidak akan menurunkan kinerja apa pun selama masa berlaku 1 tahun.
• 2×RT-qPCR Komponen EasyTM Mix-SYBR mengandung SYBR Green I, jauhkan dari cahaya.

Informasi komponen kit

2× RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR:Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, Foregene HotStar Taq DNA Polymerase, rasio dNTP yang dioptimalkan, SYBR GreenI, Mg2+, penstabil, penambah, dan pengoptimal.

ROX Reference Dye: umumnya digunakan pada amplifier PCR Real Time dari perusahaan seperti ABI dan Stratagene untuk menyesuaikan perbedaan antara tabung PCR dan tabung yang disebabkan oleh kesalahan pemuatan sampel PCR.Konsentrasi Pewarna Referensi ROX yang dibutuhkan oleh instrumen yang berbeda berbeda, dan pengguna dapat menambahkannya sesuai dengan konsentrasi instrumen yang direkomendasikan.

Tindakan pencegahan: (Silakan baca tindakan pencegahan dengan seksama sebelum menggunakan kit)

Reagen harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang, jika tidak kinerja reagen akan menurun atau menjadi tidak valid.

Reagen dalam kit harus terlindung dari cahaya dan disimpan pada suhu -20°C.

Disarankan untuk menggunakan ekstraksi sampel segar atau RNA templat yang disimpan pada -80 °C (RNA harus menghindari pembekuan dan pencairan berulang).

Untuk menghindari kontaminasi RNase, lakukan percobaan di ruang RNase-Free;ujung pipet dan tabung PCR yang digunakan harus bebas RNase;dan memakai sarung tangan dan masker sekali pakai.

Kit ini harus digunakan dengan primer khusus untuk eksperimen.Silakan pilih primer spesifik untuk gen yang akan diamplifikasi sesuai dengan kebutuhan percobaan.

Sebelum digunakan, masukkan 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR I di atas es agar benar-benar meleleh, jentik dan aduk rata sebelum digunakan;persiapan sistem harus dioperasikan pada penangas es untuk meningkatkan kinerja kit dan meningkatkan amplifikasi PCR Spesifisitas.

2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR mengandung SYBR Green I, mohon hindari cahaya yang kuat.

Konsentrasi RNA templat

RT-qPCR EasyTM (Satu Langkah)-SYBR Green I:(0.1pg-100ng total RNA)/20μl sistem.

Panduan operasi

A: Persiapan bahan dan reagen

1. Siapkan template RNA yang telah disiapkan (disarankan untuk menggunakan kit seri Foregene Total RNA Isolation Kit untuk mengekstrak dan memurnikan RNA), primer spesifik (10μM) dan bahan habis pakai serta instrumen terkait.

Catatan: Harap pastikan integritas RNA dan coba gunakan RNA yang diekstraksi dari sampel segar.

2. Taruh 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR, RNase-Free ddH2O, dan 50×ROX Reference Dye (jika perlu) di atas es agar mencair secara alami, dan jentikkan dinding tabung agar tercampur hingga digunakan.

B: Persiapan sistem RT-qPCR

2× RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR nyaman dan cepat digunakan, dan menghindari polusi selama operasi dan kesalahan eksperimental yang disebabkan oleh berbagai persiapan sistem reaksi hingga batas terbesar.Saat menggunakan, hanya setengah volume sistem reaksi (misalnya, jika sistem reaksi adalah 20μl, ambil 10μl 2×RT-qPCR larutan EasyTM Mix-SYBR), tambahkan templat RNA dan primer spesifik, dan tambahkan ddH2O Bebas RNase ke buat volumenya.Lihat Tabel 1 di bawah untuk persiapan sistem reaksi RT-qPCR spesifik

Formulir 1: Persiapan sistem RT-qPCR

1*: Biasanya konsentrasi akhir primer adalah 0,2-0,25μM untuk mendapatkan hasil yang lebih baik.Ketika kinerja reaksi buruk, konsentrasi primer dapat diatur dalam kisaran 0,1-0,5μM.

Catatan: Forward Primer dan Reverse Primer adalah primer spesifik untuk gen target.

2*: Pilih konsentrasi akhir ROX Reference Dye yang sesuai dengan instrumen PCR kuantitatif yang berbeda.Konsentrasi optimal ROX Reference Dye untuk mesin PCR kuantitatif umum ditunjukkan pada tabel berikut:

C: Pengaturan sistem reaksi RT-qPCR

• Setelah menyiapkan sistem RT-qPCR dengan mengacu pada tabel di atas, aduk perlahan (Anda dapat menggunakan ujung pipet untuk memipet dengan lembut; Anda juga dapat mencampur pada vortexer dan centrifuge sebentar untuk mengumpulkan cairan yang tersebar di dinding tabung atau tutup tabung, dan letakkan di kotak es untuk digunakan nanti).

2. Lihat pengaturan program reaksi RT-qPCR (Tabel 2) untuk mengatur suhu dan waktu reaksi.

Catatan: Untuk memastikan aktivitas 2×RT-qPCR EasyTM Mix-SYBR dan meningkatkan efisiensi amplifikasi, yang terbaik adalah menyiapkan sistem reaksi RT-qPCR setelah menyiapkan program instrumen PCR, sehingga program reaksi dapat dimasukkan segera setelah persiapan sistem selesai.

3. Untuk mendapatkan efek qPCR terbaik, PCR gradien dapat digunakan untuk mengoptimalkan kondisi reaksi untuk templat yang berbeda dan primer yang berbeda.

Catatan: Kisaran suhu ekstensi Foregene Hotstar Taq DNA Polymerase yang disediakan dalam kit ini adalah: 60-72℃, dan suhu ekstensi terbaik adalah 72℃.

Berikut ini adalah contoh kondisi reaksi RT-qPCR.Disarankan untuk menggunakan metode dua langkah untuk reaksi PCR.Ketika konsentrasi template terlalu rendah untuk menyebabkan amplifikasi non-spesifik, nilai Tm primer yang rendah menyebabkan efisiensi amplifikasi yang rendah atau pengulangan kurva amplifikasi yang buruk, dll., disarankan untuk mencoba metode tiga langkah untuk reaksi PCR.Lihat Tabel 2-1 (metode dua langkah) dan Tabel 2-2 (metode tiga langkah) untuk pengaturan kondisi reaksi RT-qPCR.

Formulir 2-1: Pengaturan program reaksi RT-qPCR (dua langkah)

Formulir 2-2: Pengaturan program reaksi RT-qPCR (tiga langkah)

1*: Waktu transkripsi terbalik dapat disesuaikan sesuai dengan kebutuhan eksperimental.Gen endogen umum seperti -Actin hanya membutuhkan 10 menit;untuk mendeteksi gen tertentu yang diekspresikan, waktu transkripsi terbalik dapat diperpanjang sesuai kebutuhan.

2*: Tetapkan waktu tertentu sesuai dengan panjang fragmen target yang diperkuat.Kecepatan amplifikasi Foregene HotStar Taq DNA Polymerase adalah 2kb/menit.

Catatan: Kondisi reaksi PCR bervariasi tergantung pada kondisi struktural templat, primer, dll. Untuk templat RNA dengan struktur sekunder kompleks, disarankan untuk menggunakan 42℃ untuk langkah pertama transkripsi balik.Dalam operasi spesifik, perlu dirancang kondisi reaksi yang optimal sesuai dengan kondisi spesifik seperti ukuran fragmen target, urutan dasar fragmen yang diamplifikasi dan kandungan GC dan panjang primer, termasuk suhu annealing, ekstensi waktu, dll.

Diagram Operasi