Persiapan dan tindakan pencegahan ekstraksi RNA

Sterilisasi ujung pipet dan tabung EP, dll.

1. Siapkan 0,1% (seperseribu) DEPC (zat yang sangat beracun) dengan air deionisasi, gunakan dengan hati-hati di lemari asam, dan simpan pada suhu 4°C jauh dari cahaya;

Air DEPC adalah air murni yang diolah dengan DEPC dan disterilkan dengan suhu dan tekanan tinggi.Diuji bebas dari RNase, DNase dan proteinase.

2. Masukkan ujung pipet dan tabung EP ke dalam 0,1% DEPC, dan pastikan ujung pipet dan tabung EP terisi dengan 0,1% DEP.

3. Lindungi dari cahaya, diamkan, semalaman (12-24 jam)

4. Kotak yang berisi ujung dan tabung EP tidak perlu direndam dalam DEPC.Setelah secara kasar mengeluarkan air DEPC di ujung atau tabung EP, bungkus dan bungkus.

5. 121 derajat Celcius, 30 menit

6. 180 derajat Celcius, keringkan selama beberapa jam (minimal 3 jam)

Catatan: a.Kenakan sarung tangan dan masker lateks saat menangani DEPC!b, atau tanpa sterilisasi DEPC, 130 , autoklaf 90 menit (banyak laboratorium sterilisasi suhu tinggi dua kali)

pertimbangan ekstraksi RNA

Dua fenomena utama RNA jaringanisolasikegagalan

Degradasi RNA dan residu pengotor dalam jaringan,mengenai degradasi, mari kita lihat dulu mengapa RNA yang diekstraksi dari sel yang dikultur tidak mudah terdegradasi.Reagen ekstraksi RNA yang ada semuanya mengandung komponen yang secara cepat menghambat RNase.Tambahkan lisat ke sel yang dikultur, dan cukup campurkan, semua sel dapat dicampur secara menyeluruh dengan lisat, dan sel benar-benar lisis.Setelah sel dilisis, bahan aktif dalam lisat segera menghambat RNase intraseluler, sehingga RNA tetap utuh.Artinya, karena sel-sel yang dikultur mudah dan sepenuhnya dikontakkan dengan lisat, RNA mereka tidak mudah terdegradasi;di sisi lain, RNA dalam jaringan mudah terdegradasi karena sel-sel di jaringan tidak mudah untuk cepat menghubungi lisat.karena kontak yang cukup.Jadi,dengan asumsi ada cara untuk mengubah jaringan menjadi sel tunggal sambil menghambat aktivitas RNA, masalah degradasi dapat diselesaikan sepenuhnya.

Penggilingan nitrogen cair adalah metode yang paling efektif.Namun, metode penggilingan nitrogen cair sangat merepotkan, terutama ketika jumlah sampel banyak.Ini memunculkan hal terbaik berikutnya: homogenizer.Itupenghomogenmetode tidak mempertimbangkan pertanyaan tentang bagaimana aktivitas RNase dihambat sebelum sel-sel dikontakkan dengan lisat, melainkan berdoa agar tingkat gangguan jaringan lebih cepat daripada tingkat di mana RNase intraseluler mendegradasi RN.

Efek homogenizer listrik lebih baik,dan efek homogenizer kaca buruk, tetapi secara umum, metode homogenizer tidak dapat mencegah fenomena degradasi.Oleh karena itu, jika ekstraksi terdegradasi, homogenizer listrik asli harus digunakan untuk menggiling dengan nitrogen cair;homogenizer kaca asli harus diubah menjadi homogenizer listrik atau langsung digiling dengan nitrogen cair.Masalahnya hampir 100% layak.diselesaikan.

Masalah residu pengotor yang mempengaruhi eksperimen selanjutnya memiliki penyebab yang lebih beragam daripada degradasi, dan solusinya juga berbeda.Kesimpulannya,jika ada degradasi atau sisa kotoran dalam jaringan, metode/reagen ekstraksi untuk bahan percobaan tertentu harus dioptimalkan.Anda tidak perlu menggunakan sampel berharga Anda untuk pengoptimalan: Anda dapat membeli beberapa hewan kecil seperti ikan/ayam dari pasar, mengambil bagian yang sesuai dari bahan untuk ekstraksi RNA, dan bagian lainnya untuk ekstraksi protein - giling dengan mulut, Ekstrak lambung dan usus.

RNA target dari RNA yang diekstraksi digunakan untuk eksperimen tindak lanjut yang berbeda, dan persyaratan kualitasnya berbeda

konstruksi perpustakaan cDNA membutuhkan integritas RNA tanpa residu inhibitor reaksi enzim;Northern membutuhkan integritas RNA yang lebih tinggi dan persyaratan yang lebih rendah untuk residu penghambat reaksi enzim;RT-PCR tidak memerlukan integritas RNA yang terlalu tinggi,tetapi menghambat reaksi enzim.Persyaratan residu sangat ketat.Masukan menentukan keluaran;setiap kali tujuannya adalah untuk mendapatkan RNA dengan kemurnian tertinggi, itu akan memakan biaya dan orang.

Pengumpulan/Penyimpanan Sampel

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Degradasi Setelah sampel meninggalkan tubuh hidup/atau lingkungan pertumbuhan aslinya, enzim-enzim endogen dalam sampel akan mulai mendegradasi RNA,dan tingkat degradasi terkait dengan kandungan enzim endogen dan suhu.Secara tradisional, hanya ada dua cara untuk sepenuhnya menghambat aktivitas enzim endogen: tambahkan lisat segera dan homogenkan secara menyeluruh dan cepat;potong kecil-kecil dan segera bekukan dalam nitrogen cair.Kedua pendekatan membutuhkan operasi yang cepat.Yang terakhir ini cocok untuk semua sampel, sedangkan yang pertama hanya cocok untuk jaringan dengan kandungan sel dan enzim endogen yang rendah dan lebih mudah untuk dihomogenisasi.Secara khusus, jaringan tanaman, hati, timus, pankreas, limpa, otak, lemak, jaringan otot, dll. sebaiknya dibekukan dengan nitrogen cair sebelum melanjutkan.

Fragmentasi dan homogenisasi sampel

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Degradasi dan Hasil Fragmentasi Sampel adalahuntuk homogenisasi menyeluruh, yaitu untuk pelepasan RNA yang lengkap dan lengkap.Sel dapat langsung dihomogenisasi tanpa rusak.Jaringan dapat dihomogenisasi hanya setelah dipatahkan.Ragi dan bakteri perlu dipecah dengan enzim yang sesuai sebelum dapat dihomogenisasi.Jaringan dengan kandungan enzim endogen yang lebih rendah dan homogenisasi yang lebih mudah dapat dihancurkan dan dihomogenisasi sekaligus dalam lisat dengan homogenizer;jaringan tanaman, hati, timus, pankreas, limpa, otak, lemak, jaringan otot dan sampel lainnya, Mereka mengandung banyak enzim endogen atau tidak mudah dihomogenisasi,sehingga gangguan jaringan dan homogenisasi harus dilakukan secara terpisah.Metode fragmentasi yang paling andal dan paling produktif adalah penggilingan dengan nitrogen cair, dan metode homogenisasi yang paling andal adalah penggunaan homogenizer listrik.Catatan khusus tentang penggilingan dengan nitrogen cair: sampel tidak boleh dicairkan selama seluruh proses penggilingan, karena enzim endogen lebih mungkin berfungsi saat dibekukan.

Pilihan lisat

Mempengaruhi kenyamanan operasi dan faktor pengotor endogen residu Larutan lisis yang umum digunakan hampir dapat menghambat aktivitas RNase.Oleh karena itu, poin kunci dalam memilih larutan lisis adalah dengan mempertimbangkan kombinasi dengan metode pemurnian.Ada satu pengecualian:sampel dengan kandungan enzim endogen tinggi disarankan untuk menggunakan lisat yang mengandung fenol untuk meningkatkan kemampuan menonaktifkan enzim endogen.

Pilihan metode pemurnian

Faktor-faktor yang mempengaruhi sisa pengotor endogen, kecepatan ekstraksi Untuk sampel bersih seperti sel, hasil yang memuaskan dapat diperoleh dengan hampir semua metode pemurnian yang ada.Tetapi untuk banyak sampel lain, terutama yang memiliki tingkat pengotor yang tinggi seperti tanaman, hati, bakteri, dll., pemilihan metode pemurnian yang sesuai sangatlah penting.Metode pemurnian sentrifugal kolom memiliki kecepatan ekstraksi yang cepat dan dapat secara efektif menghilangkan kotoran yang mempengaruhi reaksi enzimatik RNA berikutnya, tetapi harganya mahal (Foregene dapat menawarkan kit hemat biaya, lebih detail klikdi sini);menggunakan metode pemurnian yang ekonomis dan klasik, seperti pengendapan LiCl, juga dapat memperoleh hasil yang memuaskan, tetapi waktu operasinya lama..

"Tiga Disiplin dan Delapan Perhatian" untuk Ekstraksi RNA

Disiplin 1: Mengakhiri kontaminasi enzim eksogen.

Catatan 1:Kenakan masker dan sarung tangan dengan ketat.

Catatan 2:Tabung sentrifus, kepala ujung, batang pipet, tangki elektroforesis, dan meja percobaan yang terlibat dalam percobaan harus dibuang secara menyeluruh.

Catatan 3: Reagen/larutan yang terlibat dalam percobaan, terutama air, harus bebas RNase.

Disiplin 2:Memblokir aktivitas enzim endogen

Catatan 4:Pilih metode homogenisasi yang sesuai.

Catatan 5:Pilih lisat yang sesuai.

Catatan 6:Kontrol jumlah awal sampel.

Disiplin 3: Perjelas tujuan ekstraksi Anda

Catatan 7:Dengan sistem lisat apa pun yang mendekati jumlah sampel awal maksimum, tingkat keberhasilan ekstraksi turun tajam.

Catatan 8:Satu-satunya kriteria ekonomi untuk ekstraksi RNA yang sukses adalah keberhasilan dalam eksperimen berikutnya, bukan hasil.

10 Sumber Kontaminasi RNase Teratas

1. Jari adalah sumber pertama enzim eksogen, jadi sarung tangan harus sering dipakai dan diganti.Selain itu, masker juga harus dipakai, karena pernapasan juga merupakan sumber enzim yang penting.Manfaat tambahan memakai masker sarung tangan adalah untuk melindungi eksperimen.

2. Ujung pipet, tabung sentrifus, pipet – RNase tidak dapat dinonaktifkan hanya dengan sterilisasi, jadi ujung pipet dan tabung sentrifus harus diperlakukan dengan DEPC, meskipun ditandai sebagai diperlakukan dengan DEPC.Cara terbaik adalah menggunakan pipet tujuan khusus, bersihkan dengan bola kapas alkohol 75% sebelum digunakan, terutama batangnya;selain itu, pastikan untuk tidak menggunakan penghilang kepala.

3. Air/penyangga harus bebas dari kontaminasi RNase.

4. Setidaknya meja tes harus dibersihkan dengan bola kapas alkohol 75%.

• RNase endogen Semua jaringan mengandung enzim endogen, sehingga pembekuan cepat jaringan dengan nitrogen cair adalah cara terbaik untuk mengurangi degradasi.Metode penyimpanan/penggilingan nitrogen cair memang merepotkan, tetapi ini adalah satu-satunya cara untuk jaringan dengan enzim endogen tingkat tinggi.

6. Sampel RNA Produk ekstraksi RNA mungkin mengandung jejak kontaminasi RNase.

7. Ekstraksi plasmid Ekstraksi plasmid sering menggunakan Rnase untuk mendegradasi RNA, dan sisa Rnase harus dicerna dengan Proteinase K dan diekstraksi oleh PCI.

8. Penyimpanan RNA Bahkan jika disimpan pada suhu rendah, sejumlah kecil RNase akan menyebabkan degradasi RNA.Solusi terbaik untuk pengawetan RNA jangka panjang adalah suspensi garam/alkohol, karena alkohol menghambat semua aktivitas enzimatik pada suhu rendah.

9. Bila kation (Ca, Mg) mengandung ion-ion tersebut, pemanasan pada suhu 80C selama 5 menit akan menyebabkan RNA terbelah, jadi jika RNA perlu dipanaskan, larutan pengawet perlu mengandung chelating agent (1mM Sodium Sitrat, pH 6,4 ).

10. Enzim yang digunakan dalam percobaan selanjutnya mungkin terkontaminasi oleh RNase.

10 Tips untuk Ekstraksi RNA

1: Cepat mencegah aktivitas RNase.Sampel dengan cepat dibekukan setelah pengumpulan, dan RNase dinonaktifkan oleh operasi cepat selama lisis.

2: Pilih metode ekstraksi yang tepat untuk jaringan dengan kandungan ribozim tinggi, dan jaringan adiposa paling baik menggunakan metode yang mengandung fenol.

3: Kualitas prediksi membutuhkan Utara, konstruksi perpustakaan cDNA membutuhkan integritas tinggi, dan RT-PCR dan RPA (Ribonuclease protection assay) tidak memerlukan integritas tinggi.RT-PCR membutuhkan kemurnian tinggi (residu inhibitor enzim).

4: Homogenisasi menyeluruh adalah kunci untuk meningkatkan hasil dan mengurangi degradasi.

5: Periksa integritas deteksi elektroforesis RNA, 28S: 18S = 2: 1 adalah tanda lengkap, 1: 1 juga dapat diterima untuk sebagian besar eksperimen.

6: Penghapusan DNA untuk RT-PCR, analisis susunan Yang terbaik adalah menggunakan Dnase I untuk menghilangkan DNA.

7: Mengurangi kontaminasi enzim eksogen - enzim tidak dapat diimpor dari luar.

8: Ketika memekatkan asam nukleat konsentrasi rendah, reagen kopresipitasi harus ditambahkan.Tapi untuk mencegah co-presipitant yang mengandung enzim dan kontaminasi DNA.

9: Larutkan RNA secara menyeluruh, jika perlu, panaskan pada 65C selama 5 menit.

metode penyimpanan yang sesuai

Itu dapat disimpan pada –20C untuk waktu yang singkat, dan pada –80C untuk waktu yang lama.Langkah pertama dalam meningkatkan hasil RNA adalah menyadari bahwa kandungan RNA dari sampel yang berbeda sangat bervariasi.Kelimpahan tinggi (2-4ug/mg) seperti hati, pankreas, jantung, kelimpahan sedang (0,05-2ug/mg) seperti otak, embrio, ginjal, paru-paru, timus, ovarium, kelimpahan rendah (<0,05ug/mg) mg ) seperti kandung kemih, tulang, lemak.

1: Lisis sel untuk melepaskan RN – jika RNA tidak dilepaskan, hasilnya akan berkurang.Homogenisasi listrik bekerja lebih baik daripada metode homogenisasi lainnya, tetapi mungkin juga perlu dikombinasikan dengan metode lain, seperti menumbuk nitrogen cair, pencernaan enzimatik (Lysozyme/Lyticase)

2: Optimalisasi metode ekstraksi.Masalah terbesar dengan metode berbasis fenol adalah stratifikasi yang tidak lengkap dan hilangnya sebagian RNA (supernatan tidak dapat sepenuhnya dihilangkan).Stratifikasi yang tidak sempurna disebabkan oleh kandungan asam nukleat dan protein yang tinggi, yang dapat diatasi dengan menambah jumlah lisat yang digunakan atau mengurangi jumlah sampel.Langkah ekstraksi kloroform ditambahkan ke jaringan adiposa.Kehilangan RNA dapat dikurangi dengan pemompaan kembali atau dengan menghilangkan lapisan organik diikuti dengan sentrifugasi.Masalah terbesar dengan metode berbasis sentrifugasi kolom adalah kelebihan sampel.

Tip Ekstraksi Klasik

1. Pemurnian fenol: Tambahkan volume yang sama dari 1:1 Fenol/Kloroform dan aduk kuat-kuat selama 1-2 menit.Centrifuge dengan kecepatan tinggi selama 2 menit.Buang supernatan dengan hati-hati (80-90%).Jangan pernah sampai ke lapisan tengah.Volume yang sama dari larutan reaksi dapat ditambahkan ke Fenol/Kloroform dan supernatannya dibuang.Kedua supernatan dapat dicampur bersama untuk pengendapan asam nukleat untuk meningkatkan hasil.Jangan terlalu lembut saat mengaduk, dan jangan mencoba menghilangkan semua supernatannya.

2. Pencucian dengan etanol 70-80%: Selama pencucian, asam nukleat harus disuspensikan untuk memastikan bahwa sisa garam terhanyut.Pada saat yang sama, segera setelah etanol dituang, sentrifus dengan kecepatan tinggi selama beberapa detik, lalu buang sisa etanol dengan pipet.Larutkan setelah berdiri pada suhu kamar selama 5-10 menit.

11. Ekstraksi organisasi khusus

1. Jaringan fibrosa: Kunci ekstraksi RNA dari jaringan fibrosa seperti otot jantung/skelet adalah dengan merusak jaringan sepenuhnya.Jaringan ini memiliki kepadatan sel yang rendah, sehingga jumlah RNA per satuan berat jaringan rendah, dan yang terbaik adalah menggunakan jumlah awal sebanyak mungkin.Pastikan untuk menggiling jaringan secara menyeluruh dalam kondisi beku.

2. Jaringan dengan kandungan protein/lemak tinggi: kandungan lemak otak/nabati tinggi.Setelah ekstraksi PCI, supernatan mengandung flokulan putih.Supernatan harus diekstraksi kembali dengan kloroform.

3. Jaringan dengan kandungan asam nukleat/ribozim yang tinggi: limpa/timus memiliki kandungan asam nukleat dan ribozim yang tinggi.Jaringan penggilingan di bawah kondisi beku diikuti dengan homogenisasi cepat dapat secara efektif menonaktifkan ribozim.Namun, jika lisat terlalu kental (karena kandungan asam nukleat yang tinggi), ekstraksi PCI tidak akan dapat terstratifikasi secara efektif;menambahkan lebih banyak lisat dapat mengatasi masalah ini.Beberapa ekstraksi PCI dapat menghilangkan lebih banyak sisa DNA.Jika endapan putih terbentuk segera setelah penambahan alkohol, ini menunjukkan kontaminasi DNA.Ekstraksi ulang dengan PCI asam setelah pembubaran dapat menghilangkan kontaminasi DNA.

4. Jaringan tumbuhan: Jaringan tumbuhan lebih kompleks daripada jaringan hewan.Umumnya, tanaman digiling dalam kondisi nitrogen cair, sehingga degradasi RNA oleh enzim endogen jarang terjadi.Jika masalah degradasi tidak teratasi, hampir pasti disebabkan oleh pengotor yang terkandung dalam sampel.Pengotor yang terkandung dalam banyak tanaman akan menghasilkan residu, dan alasan residu sering kali karena pengotor ini memiliki beberapa kesamaan dengan RNA: Anda mengendap dan saya mengendap, dan Anda menyerap dan saya menyerap.Karakteristik ini menentukan bahwa mereka adalah penghambat enzim yang sangat kuat.

Saat ini, reagen ekstraksi RNA komersial dapat diadaptasi ke hampir semua jaringan hewan dengan sedikit penyesuaian, tetapi ada beberapa reagen ekstraksi RNA komersial yang cocok untuk sebagian besar jaringan tanaman.Untungnya, Foregene dapat memberikan yang spesial kit ekstraksi RNA tanaman, kami memilikiKit Isolasi RNA Total Tanaman,Kit Isolasi RNA Total Tanaman Plus.Yang terakhir ini dirancang khusus untuk tanaman dengan kandungan polisakarida dan polifenol yang tinggi.Untuk ekstraksi RNA, umpan balik dari pengguna lab sangat baik.

12. Pengaruh pembekuan dan pencairan sampel Sampel yang dibekukan mungkin lebih besar, dan perlu dipotong sebelum digunakan untuk ekstraksi RNA.Sampel cenderung meleleh (mungkin sebagian) selama pemotongan.Sampel beku mungkin perlu ditimbang sebelum ekstraksi RNA, dan pencairan pasti akan terjadi selama proses ini.Terkadang, pencairan sampel juga terjadi selama proses penggilingan nitrogen cair;atau sampel beku langsung ditambahkan ke lisat tanpa penggilingan nitrogen cair, dan pencairan pasti akan terjadi sebelum homogenisasi lengkap.Eksperimen telah menunjukkan bahwa jaringan beku lebih rentan terhadap degradasi RNA selama pencairan daripada jaringan segar.Kemungkinan alasannya: Proses pembekuan-pencairan mengganggu struktur di dalam sel, membuatnya lebih mudah bagi enzim endogen untuk bersentuhan langsung dengan RNA.

13. Penilaian kualitas RNA Biasanya, elektroforesis digunakan untuk menilai integritas RNA, dan A260/A280 digunakan untuk menilai kemurnian RNA.Secara teori, RNA utuh memiliki rasio 28S:18S = 2,7:1, dan sebagian besar data menekankan rasio 28S:18S = 2:1.Faktanya adalah bahwa hampir tidak ada RNA yang diekstraksi dari sampel selain sel dengan rasio 2:1 (ini diperoleh dengan menggunakan Agilent Bioanalyzer).

Hasil elektroforesis RNA dipengaruhi oleh banyak faktor, termasuk struktur sekunder, kondisi elektroforesis, beban sampel, derajat kejenuhan oleh EB, dll. Gunakan elektroforesis asli untuk mendeteksi RNA dan gunakan DNA Marker sebagai kontrol.Jika 28S pada 2kb dan 18S pada 0,9kb jelas, dan 28S: 18S > 1, integritas dapat memenuhi persyaratan sebagian besar eksperimen berikutnya.

A260/A280 adalah indikator yang menyebabkan banyak kebingungan.Pertama-tama, perlu untuk mengklarifikasi arti asli dari indikator ini untuk asam nukleat: RNA murni, A260/280-nya = sekitar 2,0.RNA murni adalah 'penyebab' dan A260/A280 = 2 adalah 'akibat'.Sekarang semua orang menggunakan A260/A280 sebagai 'penyebab', berpikir bahwa "jika A260/A280 = 2, maka RNA adalah murni", yang secara alami menyebabkan kebingungan.

Jika Anda tertarik, Anda dapat menambahkan sedikit reagen yang sering digunakan dalam ekstraksi, seperti fenol, guanidine isothiocyanate, PEG, dll., ke sampel RNA Anda, lalu ukur rasio A260/A280.Kenyataannya adalah banyak reagen yang digunakan untuk ekstraksi RNA, serta banyak pengotor dalam sampel, menyerap sekitar A260 dan A280, mempengaruhi A260/A280.

Pendekatan yang paling instruktif saat ini adalah untuk memindai sampel RNA dalam kisaran 200-300 nm.Kurva RNA murni memiliki ciri-ciri sebagai berikut: kurvanya halus, A230 dan A260 adalah dua titik belok, A300 mendekati 0, A260/A280 = sekitar 2.0, dan A260/A230 = sekitar 2.0.Jika data pemindaian tidak tersedia, rasio A260/A230 juga harus ditentukan, karena rasio ini lebih sensitif terhadap sisa semua pengotor yang mempengaruhi reaksi enzimatik.Memperhitungkan rentang linier perangkat (0,1–0,5 untuk A260).

Ada dua fenomena berguna lainnya: rasio akan menjadi sekitar 0,3 lebih rendah ketika A260/A280 diukur dalam air;sedangkan rasio yang diukur dalam 10 mM EDTA sekitar 0,2 lebih tinggi daripada yang diukur dalam 1 mM EDTA.