BAGAIMANA CARA MENINGKATKAN EFISIENSI TRANSKRIPSI REVERSE LNCRNA?

Memimpin

RNA non-coding panjang, lncRNA adalah RNA non-coding dengan panjang lebih dari 200 nukleotida, umumnya antara 200-100000 nt.lncRNA mengatur ekspresi gen pada tingkat epigenetik, transkripsi dan pasca-transkripsi, dan berpartisipasi dalam pembungkaman kromosom X, pencetakan genom dan modifikasi kromatin, aktivasi transkripsi, interferensi transkripsi, transpor nuklir, regulasi siklus sel, regulasi diferensiasi sel, dan efek kompensasi dosis (Dosis kompensasi efek) dan banyak proses regulasi penting lainnya yang terkait erat dengan terjadinya, perkembangan dan pencegahan penyakit manusia, dan saat ini salah satu hot spot di bidang biomedis.

01 Jenis dan Karakteristik LncRNA

lncRNA dibagi menjadi banyak jenis sesuai dengan sumber pembentukannya yang berbeda, seperti yang ditunjukkan pada gambar di atas.Memiliki ciri-ciri sebagai berikut:

1. lncRNA biasanya lebih panjang, dengan ekspresi dinamis dan metode penyambungan yang berbeda selama diferensiasi
2. Dibandingkan dengan gen pengkode, lncRNA biasanya memiliki tingkat ekspresi yang lebih rendah
3. Sebagian besar lncRNA memiliki kekhususan ekspresi temporal dan spasial yang jelas dalam proses diferensiasi dan perkembangan jaringan
4. Ada ekspresi khas pada tumor dan penyakit lainnya
5. Lokasi subseluler lncRNA beragam
6. Urutan kekekalannya rendah, tetapi fungsinya memiliki derajat kekekalan tertentu, dsb.

02 Pertanyaan yang Sering Diajukan tentang Transkripsi Terbalik LncRNA

Karena kandungan lncRNA yang rendah dalam sel, panjang panjang dan struktur tingkat tinggi, RNA tersebut sering memiliki struktur kompleks seperti loop batang atau jepit rambut, dan RT-qPCR rentan terhadap masalah transkripsi balik yang tidak berhasil atau efisiensi rendah.

03 Solusi transkripsi balik LncRNA

Pada aturan utama, proses virus RNA menggunakan transkriptase baliknya sendiri untuk mensintesis DNA menggunakan RNA sebagai cetakan disebut transkripsi balik.Proses penggunaan reverse transcriptase virus RNA untuk mensintesis template cDNA secara in vitro disebut transkripsi balik.Elemen utama yang termasuk dalam sistem transkripsi terbalik: RNA template, reverse transcriptase, primer dan komponen lainnya.

1.RNA template

Pengaruh template RNA pada transkripsi terbalik tercermin dalam struktur, kemurnian dan integritas.Semakin tinggi kemurnian dan integritas RNA yang diekstraksi, semakin tinggi efisiensi transkripsi balik dan semakin akurat hasil kuantitatif berikutnya.RNA yang dimurnikan dengan reagen ekstraksi RNA yang umum digunakan sering mengandung residu alkohol dan garam guanidin, yang memiliki efek penghambatan kuat pada sebagian besar transkriptase balik.

2.Reverse transcriptase

Transkriptase balik memiliki pengaruh kunci dalam keseluruhan sistem transkripsi balik.Suhu yang cocok untuk transkriptase balik yang digunakan di sebagian besar laboratorium umumnya adalah 42°C.Faktanya, pembukaan struktur RNA tingkat tinggi membutuhkan suhu yang lebih tinggi, dan persyaratan untuk transkriptase balik lebih tinggi.

3. Primer

Primer transkripsi terbalik termasuk primer spesifik gen, primer acak dan primer Oligo dT.Sebagian besar lncRNA tidak mengandung ekor poliA, dan penting untuk mencocokkan primer acak dengan Oligo dT dengan benar.

4. komponen lainnya

Mengingat fakta bahwa RNA sangat mudah terdegradasi, pengenalan komponen dalam sistem transkripsi balik dapat diminimalkan, yang secara efektif dapat mencegah masuknya RNase dan memastikan kelancaran transkripsi balik.

Foregene diperoleh dari template RNA, transkripsi balik ke qPCR Secara komprehensif mengawal deteksi lncRNA Anda

Kit Isolasi RNA Total Hewan (dengan kolom penghilangan gDNA)

Kit Isolasi RNA Total Sel (dengan kolom penghapusan gDNA)

Lnc-RT HeroTM I(Dengan gDNase)(Super Premix untuk sintesis cDNA untai pertama dari lncRNA)

PCR Waktu Nyata EasyTM-SYBR Hijau I

Keuntungan ekstraksi RNA:

Kit ini menggunakan teknologi ekstraksi RNA generasi ketiga, tidak perlu menggunakan DNase.

11 menit dari sel kultur pelat 96, 24, 12, dan 6 sumur, ekstraksi efisiensi tinggi RNA sel total bebas gDNA, kemurnian tinggi, dan kualitas tinggi.

Keuntungan dari transkripsi balik lncRNA:

Sistem transkripsi terbalik yang khusus dikembangkan untuk LncRNA untuk menghilangkan kontaminasi DNA genom dengan cepat.

Sistem transkripsi balik memiliki stabilitas termal yang tinggi dan masih memiliki kinerja transkripsi balik yang baik pada 50 °C.

Template dengan konten GC tinggi dan struktur sekunder yang kompleks dapat dibalik dengan efisiensi tinggi.

Keuntungan dari qPCR:

Hot start Foregene Taq Polymerase memiliki efisiensi amplifikasi yang lebih tinggi, sensitivitas amplifikasi yang lebih tinggi, dan spesifisitas amplifikasi yang lebih tinggi.

Real PCR Easy Mix yang dioptimalkan membuat SYBR Green I memiliki sensitivitas deteksi yang lebih tinggi, dan intensitas fluoresensinya 3-5 kali lipat dari produk serupa, yang dapat memenuhi kebutuhan berbagai jenis eksperimen kuantitatif fluoresensi.