FAQ untuk Kit Isolasi RNA Total Hewan/Sel

Analisis berikut tentang masalah yang mungkin Anda temui dalam ekstraksi RNA jaringan/sel hewan akan membantu Anda dalam eksperimen Anda.Selain itu, untuk masalah eksperimental atau teknis lainnya selain instruksi pengoperasian dan analisis masalah, kami telah mendedikasikan dukungan teknis untuk membantu Anda.Jika Anda memiliki kebutuhan, silakan hubungi kami di: 028-83360257 atau E-mali: Tech@foregene.com.

RNA tidak diekstraksi atau hasil RNA rendah

Seringkali ada berbagai faktor yang mempengaruhi efisiensi pemulihan, seperti: kandungan RNA sampel jaringan, metode operasi, volume elusi, dll.

1. Sentrifugasi es atau kriogenik (4 °C) dilakukan selama operasi.

Rekomendasi: Beroperasi pada suhu kamar (15-25 ° C) selama seluruh proses, jangan mandi es dan centrifuge pada suhu rendah.

2. Pengawetan sampel yang tidak tepat atau waktu penyimpanan sampel yang berlebihan.

Rekomendasi: Simpan sampel pada -80 °C atau bekukan dalam nitrogen cair dan hindari penggunaan beku-cair berulang kali;coba gunakan jaringan segar atau sel yang dikultur untuk ekstraksi RNA.

3. Lisis sampel tidak mencukupi.

Rekomendasi: Saat menghomogenkan jaringan, pastikan bahwa jaringan cukup homogen dan sel-sel jaringan cukup terbelah untuk menjelaskan pelepasan RNA.

4. Eluen tidak ditambahkan dengan benar.

Rekomendasi: Konfirmasikan bahwa ddH2O Bebas RNase ditambahkan tetes demi tetes ke tengah membran kolom pemurnian.

5. Volume etanol absolut yang benar tidak ditambahkan ke Buffer RL2 atau Buffer RW2.

Rekomendasi: Ikuti petunjuknya, tambahkan volume yang benar dari etanol absolut ke Buffer RL2 dan Buffer RW2 dan aduk rata sebelum menggunakan kit.

6. Dosis sampel jaringan tidak sesuai.

Rekomendasi: Gunakan 10-20 mg jaringan atau (1-5) × 106 sel per 500 l buffer RL1, karena penggunaan jaringan yang berlebihan dapat mengakibatkan pengurangan ekstraksi RNA.

7. Volume elusi tidak tepat atau elusi tidak lengkap.

Rekomendasi: Volume elusi kolom pemurnian adalah 50-200 l;jika efek elusi tidak memuaskan, disarankan untuk memperpanjang waktu penempatan suhu kamar setelah menambahkan ddH2O Bebas RNase yang dipanaskan sebelumnya, misalnya selama 5-10 menit.

8. Kolom pemurnian memiliki residu etanol setelah pencucian Buffer RW2.

Rekomendasi: Jika ada residu etanol setelah pencucian Buffer RW2, sentrifugasi tabung kosong selama 1 menit, waktu untuk operasi sentrifugasi tabung kosong dapat ditingkatkan menjadi 2 menit, atau kolom pemurnian dapat ditempatkan pada suhu kamar selama 5 menit untuk menghilangkan residu secara memadai etanol.

RNA yang dimurnikan terdegradasi

Kualitas RNA yang dimurnikan terkait dengan faktor-faktor seperti pengawetan sampel, kontaminasi RNase, dan manipulasi, dll.

1. Sampel jaringan tidak disimpan tepat waktu.

Rekomendasi: Jika sampel jaringan atau sel tidak digunakan tepat waktu setelah pengumpulan, segera kriopreservasi pada -80 °C atau nitrogen cair.Untuk mengekstrak RNA, gunakan sampel jaringan atau sel yang baru diambil bila memungkinkan.

2. Berulang kali membekukan sampel jaringan.

Rekomendasi: Saat menyimpan sampel jaringan, yang terbaik adalah memotongnya menjadi potongan-potongan kecil untuk pengawetan, dan menghapus salah satu bagian saat menggunakannya untuk menghindari pembekuan sampel yang berulang dan degradasi RNA.

3. RNase diperkenalkan atau tidak memakai sarung tangan sekali pakai, masker, dll selama operasi.

Rekomendasi: Eksperimen ekstraksi RNA paling baik dilakukan di ruang manipulasi RNA terpisah dan tabel dibersihkan sebelum eksperimen.

Kenakan sarung tangan dan masker sekali pakai selama percobaan untuk meminimalkan degradasi RNA yang disebabkan oleh pengenalan RNase.

4. Reagen terkontaminasi dengan RNase selama penggunaan.

Rekomendasi: Ganti dengan Kit Isolasi RNA Total Hewan baru untuk eksperimen terkait.

5. Tabung centrifuge, tip, dll. yang digunakan dalam manipulasi RNA terkontaminasi dengan RNase.

Rekomendasi: Pastikan bahwa tabung sentrifus, ujung, pipet, dll. yang digunakan dalam ekstraksi RNA semuanya Bebas RNase.

RNA yang diperoleh yang dimurnikan memengaruhi eksperimen hilir

RNA dimurnikan dengan kolom pemurnian, jika ion garam, kandungan protein terlalu besar akan mempengaruhi percobaan hilir, seperti: transkripsi terbalik,Northern Blot et al.

1. RNA yang dielusi memiliki residu ion garam.

Rekomendasi: Konfirmasikan bahwa volume etanol yang benar telah ditambahkan ke Buffer RW2 dan lakukan 2 pencucian kolom pemurnian pada kecepatan sentrifugal yang ditunjukkan untuk operasi;jika ada residu ion garam, tinggalkan kolom pemurnian ke Buffer RW2 selama 5 menit pada suhu kamar dan lakukan sentrifugasi untuk memaksimalkan penghilangan kontaminasi garam.

2. Residu etanol pada RNA yang terelusi.

Rekomendasi: Konfirmasikan bahwa setelah pencucian buffer RW2, lakukan operasi sentrifugasi tabung kosong pada kecepatan sentrifugasi yang ditunjukkan untuk operasi, tambah waktu operasi sentrifugasi tabung kosong menjadi 2 menit jika masih ada residu etanol, atau biarkan pada suhu kamar selama 5 menit. menit setelah sentrifugasi tabung kosong untuk memaksimalkan penghilangan residu etanol.